Некодирующие варианты
Если про интроны говорят много, то остальные некодирующие области окружены «туманом войны», и варианты в них чаще предпочитают вообще не смотреть и не выносить. Промоторы, энхансеры, 5’UTR, 3’UTR теоретически могут натворить делов. Но что с ними делать и как искать?
Строгих и универсальных правил для этих областей нет. Даже при наличии биологической гипотезы доказать причинный механизм часто сложно, поэтому «дотянуть» вариант до диагностической категории бывает практически невозможно.
Рабочая группа SVI при ClinGen опубликовала рекомендации по интерпретации некодирующих вариантов, но они задают скорее рамки оценки, чем дают простой алгоритм.
Поэтому первый вопрос, который мы должны задать себе:
Какие некодирующие области имеет смысл рассматривать?
Согласно рекомендациям, в клинической практике целесообразно ограничиваться участками, для которых существует экспериментальная или функциональная валидность:
🔘Интроны и UTR, относящиеся к хорошо валидированным транскриптам.
🔘Промоторные области, определённые как участки открытого хроматина вокруг канонического TSS (сайта начала транскрипции).
🔘Другие цис-регуляторные элементы - при условии, что существует экспериментальное подтверждение их связи с конкретным геном. Сложно😢!
Межгенные варианты без доказанной связи с геном-мишенью в рутинной диагностике обычно не рассматриваются, это уже «рокет саенс» и не для интерпретатора в вакууме лаборатории.
Чтобы вообще вынести некодирующий вариант в заключение (особенно НЕ интронные варианты), он должен пройти предварительную фильтрацию с учётом огромного количества некодирующих изменений в геноме (98% не кодирует белки).
Базовые критерии для выбора варианта:
1. Ген морбидный и установлена связь ген-фенотип (как-нибудь разберем что такое GDV 😎).
2. Вариант редкий (PM2).
Пока всё как с обычными VUS - ничего нового.
Едем дальше: когда вариант начинает становиться действительно привлекательным для вынесения?
Критерии, которые используются в рекомендациях:
🔘PP3: предикторы in silico. Применимость и доказательность инструментов ограничена, особенно вне сплайсинга. Тут самые разнообразные наборы программ, все зависит от того, какую биологическую гипотезу мы используем. Подробнее есть в таблице в рекомендациях. Спойлер: сплайсинг можно подозревать не только в интронах. Важно: сила доказательства PP3 обычно не превышает supporting.
🔘PP4: фенотип пациента высокоспецифичен и хорошо коррелирует с геном. Наш любимый!
🔘PM3: вариант обнаружен в транс с pat/lpat (для AR). Используем осторожно для интронов в больших генах - вероятность случайных редких вариантов крайне высокая.
🔘PS2/PM6: de novo рекомендации разрешают, однако важно помнить:
у каждого человека возникает в среднем ~50–80 de novo SNV за поколение.
🔘PM1: Можно применять только при наличии доказанного функционально значимого регуляторного домена, в котором наблюдается кластер патогенных вариантов. Для большинства регуляторных областей это условие не выполняется.
🔘PP1: Сегрегационные данные применимы и могут быть значимы, но редко доступны в достаточном объёме.
Функциональные исследования
И только пройдя весь этот отбор вариант может уйти на функциональное исследование, которое способно «качнуть» некодирующий вариант из VUS в Lben/Ben или Lpat/Pat.
Но давайте будем честны:
🔘функциональный анализ доступен не во всех лабораториях,
🔘он требует времени,
🔘это дорогое удовольствие,
🔘не всегда воспроизводим.
Поэтому в реальной практике вариант просто останется в статусе VUS. Именно поэтому мы рекомендуем достаточно строгий отбор кандидатов, чтобы они имели шансы на дальнейшее продвижение по карьерной лестнице (или понижение).
И, пожалуй, это главный принцип работы с некодирующими вариантами: тут очень важны высокая планка доказательности и биологическая гипотеза, которую надо отразить в заключении.
Думайте. Подписаться.
Скука интерпретатора
Если про интроны говорят много, то остальные некодирующие области окружены «туманом войны», и варианты в них чаще предпочитают вообще не смотреть и не выносить. Промоторы, энхансеры, 5’UTR, 3’UTR теоретически могут натворить делов. Но что с ними делать и как искать?
Строгих и универсальных правил для этих областей нет. Даже при наличии биологической гипотезы доказать причинный механизм часто сложно, поэтому «дотянуть» вариант до диагностической категории бывает практически невозможно.
Рабочая группа SVI при ClinGen опубликовала рекомендации по интерпретации некодирующих вариантов, но они задают скорее рамки оценки, чем дают простой алгоритм.
Поэтому первый вопрос, который мы должны задать себе:
Есть ли достаточные основания подозревать именно этот вариант в данном клиническом контексте?
Какие некодирующие области имеет смысл рассматривать?
Согласно рекомендациям, в клинической практике целесообразно ограничиваться участками, для которых существует экспериментальная или функциональная валидность:
🔘Интроны и UTR, относящиеся к хорошо валидированным транскриптам.
🔘Промоторные области, определённые как участки открытого хроматина вокруг канонического TSS (сайта начала транскрипции).
🔘Другие цис-регуляторные элементы - при условии, что существует экспериментальное подтверждение их связи с конкретным геном. Сложно😢!
Межгенные варианты без доказанной связи с геном-мишенью в рутинной диагностике обычно не рассматриваются, это уже «рокет саенс» и не для интерпретатора в вакууме лаборатории.
Чтобы вообще вынести некодирующий вариант в заключение (особенно НЕ интронные варианты), он должен пройти предварительную фильтрацию с учётом огромного количества некодирующих изменений в геноме (98% не кодирует белки).
Базовые критерии для выбора варианта:
1. Ген морбидный и установлена связь ген-фенотип (как-нибудь разберем что такое GDV 😎).
2. Вариант редкий (PM2).
Пока всё как с обычными VUS - ничего нового.
Едем дальше: когда вариант начинает становиться действительно привлекательным для вынесения?
Критерии, которые используются в рекомендациях:
🔘PP3: предикторы in silico. Применимость и доказательность инструментов ограничена, особенно вне сплайсинга. Тут самые разнообразные наборы программ, все зависит от того, какую биологическую гипотезу мы используем. Подробнее есть в таблице в рекомендациях. Спойлер: сплайсинг можно подозревать не только в интронах. Важно: сила доказательства PP3 обычно не превышает supporting.
🔘PP4: фенотип пациента высокоспецифичен и хорошо коррелирует с геном. Наш любимый!
🔘PM3: вариант обнаружен в транс с pat/lpat (для AR). Используем осторожно для интронов в больших генах - вероятность случайных редких вариантов крайне высокая.
🔘PS2/PM6: de novo рекомендации разрешают, однако важно помнить:
у каждого человека возникает в среднем ~50–80 de novo SNV за поколение.
🔘PM1: Можно применять только при наличии доказанного функционально значимого регуляторного домена, в котором наблюдается кластер патогенных вариантов. Для большинства регуляторных областей это условие не выполняется.
🔘PP1: Сегрегационные данные применимы и могут быть значимы, но редко доступны в достаточном объёме.
Функциональные исследования
И только пройдя весь этот отбор вариант может уйти на функциональное исследование, которое способно «качнуть» некодирующий вариант из VUS в Lben/Ben или Lpat/Pat.
Но давайте будем честны:
🔘функциональный анализ доступен не во всех лабораториях,
🔘он требует времени,
🔘это дорогое удовольствие,
🔘не всегда воспроизводим.
Поэтому в реальной практике вариант просто останется в статусе VUS. Именно поэтому мы рекомендуем достаточно строгий отбор кандидатов, чтобы они имели шансы на дальнейшее продвижение по карьерной лестнице (или понижение).
И, пожалуй, это главный принцип работы с некодирующими вариантами: тут очень важны высокая планка доказательности и биологическая гипотеза, которую надо отразить в заключении.
Думайте. Подписаться.
Скука интерпретатора