Сегодня продолжение коллаборации! Часть 1 тут
С нами Эля Шнайдер (лаб. молекулярной гематологии, «Шаарей цедек», Иерусалим).
Часть 2: Самое легкое
3⃣Как интерпретировать всю эту хромосомную вечеринку?
Часть из вариантов плохого качества, часть - попадают в маскированные зоны, которые OGM недоступны (об этом позже).
Для понимания того, что распространено в популяции, а что нет, у Bionano есть свой собственный аналог gnomAD - внутренняя база "здоровых". Например, для гематологических заболеваний порог для того, чтобы рассматривать далее вариант как возможно патогенный - это 1% от этой внутренней базы данных.
Так же для CNV активно используется DGV (на безрыбье и рак рыба).
Порог для VAF такой же, как для соматических мутаций в NGS - 5%
Данные оптического картирования специфические, поэтому и работать с ними приходится в специальном софте. Оптимальный вариант сейчас - это VIA (позволяет делать автоматическую преклассификацию, её можно удобно подстроить под свои задачи).
Каждая лаборатория выбирает свой способ стратификации рисков, но чаще всего это AMP/ASCO/CAP классификация на Tier I, II, III/IV. В гематологии мы опираемся на гайдлайны ELN и WHO.
Основа поиска и интерпретации в OGM - это bed файлы. По гайдлайнам составляется bed (по сути панель) с основными драйверными генами для каждой болезни и по ним выискиваются аберрации. Так же часто приходится проверять и те варианты, которые не встречаются в гайдлайнах, но про них есть немногочисленные статьи - вот тут очень помогает автоматический классификатор Franklin (для OGM так же, как и для FISH и CMA используется нотация ISCN).
С генетическими заболеваниями OGM тоже позволяет работать и для этого даже есть встроенная в VIA функция анализа триад родители-ребенок.
В целом, процесс интерпретации данных OGM бывает довольно трудоемким, но дает врачам сильно больше информации, чем другие цитогенетические методы.
4⃣В чем преимущества OGM перед другими методами цитогеномики и секвенирования третьего поколения?
⭕Разрешение, которое может доходить до 500 bp.
⭕Можно разглядеть все типы структурных и копийных вариантов. Здесь может потягаться разве что только секвенирование третьего поколения.
⭕Быстрота подготовки образца и получения результата. В среднем требуется всего 7 дней от пробоподготовки до готовой интерпретации. Сам протокол для подготовки библиотеки OGM относительно простой и не требует клеточных культур.
⭕Сильно доступнее по цене, чем тот же PacBio, а для рутинной клинической работы, как правило, достаточно комбинации OGM + панель NGS для конкретного класса заболеваний.
⭕Хотя это и не single cell технология, но клональность тоже позволяет видеть.
⭕Как правило для работы с OGM в команде лаборатории не требуется биоинформатик (но его наличие существенный плюс).
Звучит всё классно, но где подвох?
5⃣Неприятные ограничения OGM
Как любая технология, OGM имеет свои проблемы.
⭕Требования к образцу: так как для оптического картирования требуется сверхдлинная ДНК в большом количестве (около 1 млн клеток), архивные образцы или образцы, где мало клеток, могут не подойти для анализа. Так же есть проблема с FFPE.
⭕Из-за того, что основа оптического картирования - это энзиматическое меченье, а анализ данных напрямую зависит от качества референсного генома - закрытые участки хроматина, центромеры, теломеры, повторы и другие комплексные участки часто картируются плохо. И для того, чтобы подтвердить вариант, попавший в такую область, нужно использовать другие цитогенетические методы.
⭕Каждая координата любого варианта имеет разброс до нескольких тпн. Например, точную точку разрыва при транслокациях, как секвенирование, OGM не покажет, а это бывает важно (например, для фьюжн гена BCR-ABL1).
То есть, всё же еще мы не можем «с ноги открыть дверь» и зайти на хромосомную вечеринку - только заглянуть в проем, не рассматривая отдаленные углы.
OGM невероятно мощная и завораживающая технология (одна съемка бегущих меченных хромосом чего стоит 😉), но в клинике она не существует отдельно, а лишь дополняет другие методы: молекулярные тесты и NGS.
Продолжение в комментариях 👇🏻
С нами Эля Шнайдер (лаб. молекулярной гематологии, «Шаарей цедек», Иерусалим).
Часть 2: Самое легкое
3⃣Как интерпретировать всю эту хромосомную вечеринку?
Часть из вариантов плохого качества, часть - попадают в маскированные зоны, которые OGM недоступны (об этом позже).
Для понимания того, что распространено в популяции, а что нет, у Bionano есть свой собственный аналог gnomAD - внутренняя база "здоровых". Например, для гематологических заболеваний порог для того, чтобы рассматривать далее вариант как возможно патогенный - это 1% от этой внутренней базы данных.
Так же для CNV активно используется DGV (на безрыбье и рак рыба).
Порог для VAF такой же, как для соматических мутаций в NGS - 5%
Данные оптического картирования специфические, поэтому и работать с ними приходится в специальном софте. Оптимальный вариант сейчас - это VIA (позволяет делать автоматическую преклассификацию, её можно удобно подстроить под свои задачи).
Каждая лаборатория выбирает свой способ стратификации рисков, но чаще всего это AMP/ASCO/CAP классификация на Tier I, II, III/IV. В гематологии мы опираемся на гайдлайны ELN и WHO.
Основа поиска и интерпретации в OGM - это bed файлы. По гайдлайнам составляется bed (по сути панель) с основными драйверными генами для каждой болезни и по ним выискиваются аберрации. Так же часто приходится проверять и те варианты, которые не встречаются в гайдлайнах, но про них есть немногочисленные статьи - вот тут очень помогает автоматический классификатор Franklin (для OGM так же, как и для FISH и CMA используется нотация ISCN).
С генетическими заболеваниями OGM тоже позволяет работать и для этого даже есть встроенная в VIA функция анализа триад родители-ребенок.
В целом, процесс интерпретации данных OGM бывает довольно трудоемким, но дает врачам сильно больше информации, чем другие цитогенетические методы.
4⃣В чем преимущества OGM перед другими методами цитогеномики и секвенирования третьего поколения?
⭕Разрешение, которое может доходить до 500 bp.
⭕Можно разглядеть все типы структурных и копийных вариантов. Здесь может потягаться разве что только секвенирование третьего поколения.
⭕Быстрота подготовки образца и получения результата. В среднем требуется всего 7 дней от пробоподготовки до готовой интерпретации. Сам протокол для подготовки библиотеки OGM относительно простой и не требует клеточных культур.
⭕Сильно доступнее по цене, чем тот же PacBio, а для рутинной клинической работы, как правило, достаточно комбинации OGM + панель NGS для конкретного класса заболеваний.
⭕Хотя это и не single cell технология, но клональность тоже позволяет видеть.
⭕Как правило для работы с OGM в команде лаборатории не требуется биоинформатик (но его наличие существенный плюс).
Звучит всё классно, но где подвох?
5⃣Неприятные ограничения OGM
Как любая технология, OGM имеет свои проблемы.
⭕Требования к образцу: так как для оптического картирования требуется сверхдлинная ДНК в большом количестве (около 1 млн клеток), архивные образцы или образцы, где мало клеток, могут не подойти для анализа. Так же есть проблема с FFPE.
⭕Из-за того, что основа оптического картирования - это энзиматическое меченье, а анализ данных напрямую зависит от качества референсного генома - закрытые участки хроматина, центромеры, теломеры, повторы и другие комплексные участки часто картируются плохо. И для того, чтобы подтвердить вариант, попавший в такую область, нужно использовать другие цитогенетические методы.
⭕Каждая координата любого варианта имеет разброс до нескольких тпн. Например, точную точку разрыва при транслокациях, как секвенирование, OGM не покажет, а это бывает важно (например, для фьюжн гена BCR-ABL1).
То есть, всё же еще мы не можем «с ноги открыть дверь» и зайти на хромосомную вечеринку - только заглянуть в проем, не рассматривая отдаленные углы.
OGM невероятно мощная и завораживающая технология (одна съемка бегущих меченных хромосом чего стоит 😉), но в клинике она не существует отдельно, а лишь дополняет другие методы: молекулярные тесты и NGS.
Продолжение в комментариях 👇🏻